小鼠原代星形胶质细胞培养全流程解析：
 

　　一、实验前准备：关键试剂与器械配置
 

　　培养基体系
 

　　基础培养基：DMEM/F12或Astrocyte Basal Medium(ABM)，需添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素(P/S)双抗溶液。
 

　　冻存液：基础培养基 + 20% FBS + 10% DMSO(二甲基亚砜)，用于细胞长期保存。
 

　　消化液：0.25%胰蛋白酶 + 0.1%胶原酶II混合液，或专用试剂盒(如PriCells Isolation Kit)，用于组织解离。
 

　　洗涤液：1×PBS(pH 7.4) + 1% P/S，用于去除残留酶和杂质。
 

　　器械与耗材
 

　　基础器械：直剪、眼科剪、眼科镊、止血钳、10ml注射器、玻璃滴管、烧杯、15ml离心管。
 

　　培养容器：T25/T75培养瓶、6孔/12孔培养板，需提前用多聚赖氨酸(10×稀释至1×)包被2小时，PBS清洗后备用。
 

　　过滤设备：0.22μm滤膜，用于培养基和试剂的无菌过滤。
 

　　环境控制
 

　　无菌操作台：提前30分钟开启紫外线照射，操作前用75%酒精擦拭台面。
 

　　培养箱：设定37℃、5% CO₂、饱和湿度，培养瓶需静置2-3小时使细胞适应环境。
 

　　二、取材与组织处理：精准操作减少污染
 

　　动物选择
 

　　年龄：优先选用新生1-3天的小鼠(如C57BL/6或昆明小鼠)，此时星形胶质细胞增殖活跃，成纤维细胞污染风险低。
 

　　消毒：75%酒精浸泡30秒，无菌PBS漂洗3次，去除表层血丝和毛发。
 

　　脑组织剥离
 

　　步骤：
 

　　用眼科剪沿颅骨中线剪开皮肤，暴露颅骨。
 

　　血管钳夹住颈部，眼科剪从枕部向前分离颅骨，取出完整脑组织。
 

　　置于预冷PBS中，剔除脑膜、血管及海马体(避免神经元污染)。
 

　　将皮层组织剪碎至1mm³碎片，或用眼科镊撕碎成糜状。
 

　　脊髓组织处理(可选)
 

　　剥离：沿脊柱中线剪开皮肤，暴露脊髓，用弯镊夹住脊神经根部完整剥离。
 

　　清洗：去除脊膜和血管后，剪碎至1mm³碎片，后续步骤与脑组织相同。
 

　　三、细胞分离与纯化：多方法联合提升纯度
 

　　酶解消化
 

　　条件：将组织碎片转移至15ml离心管，加入消化液(37℃水浴震荡消化15-20分钟，每5分钟轻弹离心管防止沉淀)。
 

　　终止：加入等体积含血清培养基终止反应，100目筛网过滤去除未消化组织。
 

　　差速贴壁法
 

　　原理：成纤维细胞贴壁速度(15分钟)快于星形胶质细胞(1-2小时)。
 

　　操作：
 

　　将悬液转移至新培养瓶静置15分钟，未贴壁的悬浮细胞(含星形胶质细胞)转回原瓶。
 

　　重复2-3次，纯度可达90%以上。
 

　　摇培法
 

　　条件：原代细胞培养至第3天，置于37℃恒温摇床(260 rpm)震荡2小时。
 

　　处理：用吸管吸取培养液轻轻吹打瓶底，去除贴壁不牢的杂细胞(如小胶质细胞、少突胶质细胞)，离心后补入新鲜培养基。
 

　　试剂盒辅助
 

　　推荐产品：
 

　　PriCells Isolation Kit：含优化消化酶和终止液，简化操作流程。
 

　　NeuroCult™ Astrocyte Medium：专用培养基支持星形胶质细胞长期增殖。
 

　　四、培养条件优化：关键参数控制
 

　　接种密度
 

　　初始密度：1×10⁶个/ml(T25培养瓶)或3×10⁴个/孔(6孔板)，避免密度过低导致细胞接触抑制失效。
 

　　换液策略
 

　　频率：每3-5天换液，首次换液在接种后24小时(去除未贴壁细胞和杂质)。
 

　　操作：吸弃旧培养基，加入等量新鲜培养基，动作轻柔避免冲起细胞。
 

　　环境参数
 

　　pH值：维持在7.2-7.4，过碱会加速细胞老化。
 

　　氧浓度：常规培养为5% CO₂，最新研究建议脊髓星形胶质细胞培养时降至3%(模拟体内微环境，需定制三气培养箱)。
 

　　生长因子补充
 

　　推荐添加：2mM谷氨酰胺(提升细胞活性)、10ng/ml bFGF(促进增殖)、1% N2 Supplement(支持长期培养)。
 

　　五、细胞鉴定与质量控制：多维度验证纯度
 

　　形态学观察
 

　　相差显微镜：细胞呈星形状，密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列，具有接触抑制特性。
 

　　扫描电镜：清晰显示胞体突起和终足结构(与毛细血管壁附着)。
 

　　免疫荧光染色
 

　　GFAP检测：
 

　　4%多聚甲醛固定20分钟，0.3% TritonX-100透膜处理。
 

　　山羊血清封闭30分钟，加入GFAP一抗(1:500稀释)4℃过夜。
 

　　荧光二抗(1:1000稀释)避光孵育1小时，DAPI染核后荧光显微镜观察。
 

　　结果：胞质呈现黄绿色荧光，终足结构清晰，纯度≥90%。
 

　　OX-42(CD11b/c)检测：用于排除小胶质细胞污染(小胶质细胞呈阳性)。
 

　　功能验证
 

　　谷氨酸摄取实验：检测细胞对谷氨酸的摄取能力(正常值≥50 nmol/mg protein/10min)。
 

　　K⁺/H⁺浓度调节：通过离子选择性电极测定细胞外液中K⁺/H⁺浓度变化，验证细胞功能。
 

　　六、常见问题与解决方案
 

　　细胞贴壁困难
 

　　原因：多聚赖氨酸包被不足或培养基pH异常。
 

　　处理：延长包被时间至4小时，或改用纤连蛋白(5μg/cm²)预处理。
 

　　增殖缓慢
 

　　原因：血清质量差或生长因子缺乏。
 

　　处理：使用进口胎牛血清(如Gibco)，添加10ng/ml EGF或1% N2补充剂。
 

　　污染处理
 

　　细菌污染：加入两性霉素B(2.5μg/ml)短期干预(连续使用不超过3天)。
 

　　支原体污染：使用BM-Cyclin试剂盒(罗氏)治疗3个周期(每周期7天)。
 

　　细胞老化
 

　　表现：突起缩短、胞体增大、GFAP表达下降。
 

　　预防：控制传代次数(≤10代)，避免过碱环境(pH>7.4)。
 

　　七、应用场景与实验模型
 

　　神经退行性疾病研究
 

　　阿尔茨海默病：研究Aβ寡聚体诱导的星形胶质细胞活化(GFAP表达上调3-5倍)。
 

　　脊髓损伤：利用C8-D1A细胞系(源自小鼠小脑星形胶质细胞)筛选神经保护剂(如α-硫辛酸可抑制Nedd4样泛素蛋白连接酶，减轻神经炎症)。
 

　　药物筛选与毒性评价
 

　　神经毒素模型：暴露于MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)后，星形胶质细胞释放IL-1β、TNF-α等促炎因子，模拟帕金森病病理过程。
 

　　高通量筛选：结合自动化成像系统，评估化合物对细胞突起长度、分支数量的影响(如NGF可增加突起长度20%-30%)。
 

　　脑机接口与组织工程
 

　　生物材料兼容性：测试水凝胶支架对星形胶质细胞黏附、增殖的影响(弹性模量范围：1-10 kPa)。
 

　　3D培养模型：使用旋转生物反应器构建类脑组织，研究血脑屏障通透性(跨内皮电阻值需≥150 Ω·cm²)。