取材与组织处理：无菌摘取新生鼠大脑皮质，剥离软脑膜与血管，用预冷 PBS 漂洗 3 次去除血污，剪碎至 1mm³ 组织块，加入 0.25% 胰蛋白酶，37℃恒温消化 15min，期间轻摇 2 次；消化终止后加入含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基，用巴氏吸管反复吹打至单细胞悬液，200 目筛网过滤去除组织残渣。

 

接种与初代培养：将过滤后的细胞悬液 1000r/min 离心 5min，弃上清后用完全培养基重悬，调整细胞密度至 1×10⁶个 /mL，接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱；24h 首次换液，去除未贴壁的神经元与细胞碎片，后续每 3d 换液 1 次，培养 7-10d 至细胞融合度达 90% 以上。

 

纯化与传代：将融合的混合胶质细胞培养瓶置于 37℃恒温摇床，180r/min 振摇 30min，去除贴壁较松的小胶质细胞；弃上清后用 PBS 漂洗 2 次，加入 0.25% 胰酶消化 5min，吹打脱壁后离心重悬，按 1:2 比例传代至新包被培养瓶，此为 P1 代星形胶质细胞，继续培养 3-5d 至融合。

 

成熟培养与鉴定：P1 代细胞融合后改为每 2d 换液 1 次，继续培养 2-3 周至细胞成熟，成熟细胞呈典型 “铺路石” 状，胞体扁平多角形；取成熟细胞进行 GFAP 免疫荧光鉴定，4% 多聚甲醛固定 30min，一抗孵育过夜后荧光二抗孵育 1h，DAPI 染核，荧光显微镜下观察，GFAP 阳性率≥95% 即为合格原代星形胶质细胞。

 

常规维护与使用：成熟细胞可用于后续实验，若需传代培养建议不超过 P3 代，避免细胞表型丢失；实验前 24h 换液 1 次，保证细胞活性，培养过程中密切观察，及时清除污染或凋亡细胞。