l 细胞鉴定

STR鉴定已通过

l 细胞来源

国家资源库

l 细胞背景

该细胞稳定表达SV40大T抗原，并且促进最适病毒产物的产生。

l 细胞特性

1.来源：胚肾

2.形态：圆形，贴壁生长+悬浮生长

3.含量：>1x106  细胞数

4.规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5.用途：仅供科研使用。

l 培养条件：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

l 注意事项：

1. 细胞复苏或传代后会有少部分的细胞贴壁和部分悬浮的细胞，复苏两天后细胞会从贴壁细胞向外开始生长，有时细胞再生长过程中，细胞会再贴壁细胞的上方生长，形成不同的细胞层，这种情况会有发生。 在细胞复苏的一周内，培养瓶中 通常会有悬浮的活的细胞团，在换液过程中不要丢弃在这些活的悬浮细胞，可以通过离心（125×g）回收细胞，重新打回到培养瓶中，分离或者丢弃漂浮的活细胞会使细胞数量变少，引起细胞的停滞生长或细胞死亡。

2.培养条件的细微变化，尤其是pH和培养基中血清的质量，可能会影响细胞的生长状况，在细胞的生长过程中会有细胞内的液泡出现，特别在细胞快要融合是会出现这种情况。培养细胞时使用未被灭活的高质量、低内毒素的胎牛血清，可以使细胞更好的贴壁和形成单层细胞。

3. 细胞在生长过程中可以通过将血清浓度提到到20%来改善细胞生长缓慢的情况。（参考atcc 有关该细胞的描述）

l 细胞培养：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL*培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，*培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml*培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为轻微贴壁和少量悬浮培养细胞，传代可以参考以下方法：

1. 收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3. 将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的*培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

l 运输形式：

低温：（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

常温（2） T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

l 生物安全

1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。